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原核表达实验方法(一)

一、实验原理

1、E .coli 表达系统

E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后,通过温度的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达

提高外源基因表达水平的基本手段之一,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同,因启动子不同,诱导表达要根据具体情况而定。

二、实验材料

1、诱导表达材料

(1 )LB (Luria—Bertani))培养基

酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10g

NaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%

蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0

适用范围:大肠杆菌

(2 )IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中,0 .22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 ml /份,-20 ℃ 保存。

(3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液:

50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (电泳级)

0.1 % 溴酚蓝

10 % 甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 )酶溶法

(1)裂解缓冲液:

50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。

(3)10 mg / ml 溶菌酶。

(4)脱氧胆酸。

(5)1 mg / ml DNase I。

2 )超声破碎法

(1 )TE 缓冲液。

(2 )2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:

100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚蓝

20 % 甘油

 


 
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