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EMSA实验

凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和DNA序列相结合的技术,最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用,可用于定性和定量分析。分为2种类型:同位素标记探针,非同位素标记探针。

 

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

 

流程:探针的标记,探针的纯化,EMSA胶的配制,EMSA的结合反应,探针冷竞争反应,突变探针冷竞争,super-shift 反应,电泳。

 
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